Boreas BOREAS  NATURAL

Mas Sánchez, E; Ciriza Astrain, J; Lacasa Benito, I; MIana-Mena, J; Osta Pinzolas, R.
Laboratorio de Genética, Bioquímica y Grupos Sanguíneos. 
Facultad de Veterinaria. 
Universidad de Zaragoza. 
* E-mail: osta@posta.unizar.es

Palabras clave: terapia génica, transgén, DNA, fase clínica.

Resumen: Terapia génica es el proceso por el cual un nuevo gen es introducido en células de un individuo para producir un efecto terapéutico. Se realiza una breve descripción de la metodología utilizada y de algunas enfermedades en las que ya se está experimentando en fase clínica.

Zaragoza, 10 de septiembre de 2001

  1. ¿Qué es la terapia génica?
  2. Introducción al transgén
  3. Enfermedades candidatas a la terapia génica

1. Qué es la terapia génica?

Podemos definir la terapia génica como el proceso por el cual un nuevo gen es introducido en células de un individuo para producir un efecto terapéutico. Dicho efecto puede ser una activación o una supresión de alguna función fisiológica que se está produciendo incorrectamente en el individuo a tratar.

Analicemos un poco más los dos efectos terapéuticos que este gen introducido puede realizar. En el caso de activar una función, podemos fijarnos en el caso de la inmunodeficiencia combinada severa donde la enzima ADA (adenosin desaminasa) está fallando. Lo que se ha intentado en esta enfermedad es introducir el gen que codifica para esta enzima de forma que realice la función que en el organismo no está realizando correctamente. Hoy en día sigue en experimentación aunque ya en fase I y II en humanos.

Respecto a suprimir una función que está siendo errónea o perjudicial para el organismo, podemos fijarnos en el caso del cáncer. En esta enfermedad, hay una proliferación incontrolada de células tumorales que causan un daño en el organismo. La terapia génica en este caso intenta suprimir a esas células tumorales introduciendo genes que denominaremos "asesinos" hacia estas células defectuosas para eliminarlas, evitando así la proliferación de éstas y por tanto el desarrollo incontrolado del tumor. El tratamiento del melanoma fue una de las primeras pruebas realizadas.

Los tipos de terapia génica existentes respecto al modo de introducir el gen en el organismo pueden ser clasificados en "in vivo" y "ex vivo". La terapia génica "ex vivo" consiste en la realización de una primera fase en el laboratorio, de modo que obtenemos células modificadas genéticamente (contiene el gen que queremos expresar en el organismo) y que posteriormente introduciremos en el individuo. La terapia génica "in vivo" consiste en la introducción del gen mediante un vehículo para que lo inserte en las células del paciente. Estos vehículos son los llamados vectores (también utilizados "in vitro").

Antes de explicar más detalladamente el modo de introducción del transgén y ver las enfermedades en las que se aplica la terapia génica, es conveniente definir de forma clara qué es un transgén, también denominado construcción genética. Podríamos definirlo como un conjunto de uno o más genes y secuencias reguladoras que controlan la expresión de éste. Este transgén es el que tiene la función terapéutica, y es el que la terapia génic Hasta el momento no se ha realizado ninguna experiencia, a pesar de ser lo más idóneo en un tratamiento, debido a su dificultad.

Actualmente la mayoría de las experiencias se están realizando en modelos animales, pero también existen ya ensayos clínicos en humanos. Para conocer en qué situación se encuentran dichos ensayos clínicos se puede visitar la página web http://www.wiley.co.uk/wilechi/genmed/clinical/related-sites.htm  actualizada de forma continua y donde podemos encontrar: las enfermedades que se están tratando, los vectores que se están utilizando, los países que lo llevan a cabo y los resultados de las experiencias realizadas.

Como datos más interesantes podemos decir que el 50% de las pruebas se están llevando a cabo con vectores retrovirales, siendo la enfermedad más sometida a este tipo de pruebas el cáncer. Estados Unidos es el país donde se están realizando mayor número de experiencias seguido por la Unión Europea.

2. Introducción del transgén

A pesar de que no es fácil la clasificación, hemos creído conveniente dividir el modo de introducción en dos tipos: los directos y los que utilizan determinados vehículos (sistemas indirectos).

2.1- Métodos directos

SISTEMAS QUÍMICOS

Transferencia con fosfato de calcio

Se empezó a usar esta técnica en los años 60, pero fue en los 70 cuando se empezó a desarrollar suficientemente para tener buenas eficacias de transfección. Se basa en la precipitación del DNA exógeno y los iones de calcio, provocando que la célula, mediante endocitosis, introduzca el DNA en su interior. La eficacia de transfección puede llegar al 10% de las células, aunque suele ser transitoria.

No es una técnica que provoque toxicidad en las células pero la expresión del transgen es muy pequeña. Únicamente se usa en cultivos celulares, y por lo tanto su aplicación es "ex vivo".

SISTEMAS FÍSICOS

Microinyección

Consiste en colocar el DNA mediante una inyección en el núcleo de las células. Al introducirlo directamente allí, evitamos la degradación citoplasmática y lisosomal. Se realiza mediante un micromanipulador, microscopio invertido que permite la visualización.

Las células que sobreviven y han insertado el material genético presentan una alta eficacia de expresión del mismo. La técnica es muy laboriosa y necesita células aisladas para su realización. Este sistema se suele utilizar "ex vivo". En el caso de inyección en embriones se denomina terapia génica germinal siendo un método "in vivo".

Electroporación

Se introduce la construcción génica mediante un choque eléctrico a las células que provoca la formación de poros en sus membranas , por donde entra el transgén. Está especialmente indicado para células con una alta tasa de proliferación. Sin embargo, muchas células mueren al no soportar el choque eléctrico por lo que muchas veces no es la forma más indicada en algunos tipos celulares.

DNA desnudo

Consiste en la introducción del DNA en una solución salina o sérica, normalmente mediante inyección intramuscular, para conseguir la expresión del transgén. Se ha observado actualmente expresión en timo, piel, músculo cardíaco y músculo esquelético. No se conoce el mecanismo por el que llega a entrar a la célula aunque se postula que es a través del complejo del poro nuclear.

Tiene un bajo porcentaje de células transfectadas, no hay integración en el genoma y una vez inyectado no hay replicación en el genoma. Este es un sistema utilizado para la realización de la terapia génica "in vivo".

2.2- Métodos directos (mediados por vectores)

VECTORES NO VIRALES

Liposomas

En 1965 se descubrió que los liposomas (bolsas rodeadas de una membrana lipídica a semejanza de una célula eucariota animal) eran capaces de hacer entrar DNA en la célula, pero hasta 1980 no se consiguió una eficacia de transfección adecuada. Existen dos tipos de liposomas: liposomas catiónicos y liposomas aniónicos.

Liposomas catiónicos

Se encuentran cargados positivamente por lo que interaccionan con la carga negativa del DNA. Existen muchos lípidos que se usan para formar estos liposomas e incluso se están probando mezclas de estos. Son recomendables en transfecciones "in vitro".

Las ventajas de los liposomas es que protegen de la degradación al transgén hasta su llegada al núcleo. La talla del DNA introducido en ellos no tiene límite. Podemos hacerlos llegar a tejidos específicos incluyendo receptores en la capa lipídica.
Sin embargo como desventaja presentan la baja eficacia de transfeción, una expresión transitoria, cierto grado de toxicidad celular y pueden ser inhibidos por componentes séricos.

Biolística o Gene-gun

Consiste en el bombardeo de los tejidos con partículas de oro o tungsteno que llevan adheridas a ellas el DNA. El bombardeo se realiza mediante una descarga con helio como si fuera una pistola (de allí el nombre de la técnica).

La capacidad de penetración es limitada usándose en líneas celulares, epidermis, músculo e hígado. Su expresión es transitoria y en la zona de descarga se produce una gran muerte celular. Esta técnica puede realizarse "ex vivo" (en el caso de células animales) e "in vivo" (en el caso de células vegetales).

Vectores virales

Esta metodología comienza en 1968 cuando se demuestra que los virus son capaces de infectar células de mamífero. El desarrollo en 1989 de las células empaquetadoras (aportan la composición proteica que necesitan los virus para su funcionalidad ya que ésta ha sido eliminada del genoma viral) supuso un avance importante en esta metodología al aumentar la titulación en virus no patógenos. En todos los casos vamos a eliminar el mayor número de genes y secuencias al virus para que pueda captar el DNA exógeno. Los vectores virales pueden ser utilizados tanto "in vivo" como "ex vivo". Hasta el momento los virus más utilizados en terapia génica son los siguientes:

 - Retrovirus

Son virus ARN que tienen capacidad para integrar genes terapéuticos relativamente grandes (un máximo de 8 Kb). Necesitan de células empaquetadoras para su obtención. Se transfiere el DNA del virus mediante la técnica del fosfato de calcio a las células empaquetadoras. Posteriormente se realiza una segunda transducción en la cual introducimos la construcción génica de interés.

Los virus inyectados en el huésped integran su DNA en el genoma del huésped expresando así el gen que le hemos añadido. Como las proteínas del virus no son expresadas por el huésped, no tenemos una respuesta inmunitaria. Tienen una alta eficacia de transducción y también de expresión, siendo un sistema bien estudiado. 

Sin embargo, únicamente sirven para infectar células del huésped que se encuentran en división. Además los títulos de virus obtenidos hasta ahora son bajos y la integración en el genoma es al azar.

Existen también vectores basados en el virus del SIDA (HIV), cuyo genoma es más complejo pero con un funcionamiento similar al que hemos visto. Son los denominados lentivirus.

 - Adenovirus

Son una familia de virus ADN que causan infecciones en el tracto respiratorio humano. Se pueden llegar a insertar en ellos hasta 7.5 Kb. de DNA exógeno. Normalmente en terapia génica se utiliza el serotipo 5, aunque existen hasta 42 serotipos diferentes que infectan a humanos.

En este caso no se necesita la integración del material hereditario del virus en el del huésped para su replicación, por lo tanto tampoco el transgén será introducido en el genoma de la célula. Y por tanto tampoco necesitan que las células infectadas estén dividiéndose para su replicación.

La gran ventaja de usar un adenovirus como vector es la alta eficacia de transducción, al igual que la expresión de la construcción génica introducida, sin embargo ésta es transitoria (pocas semanas). Esto último obligaría a tratamientos periódicos lo cual es un inconveniente ya que los adenovirus producen respuesta inmune celular e inflamatoria.

 - Virus adenoasociados (VAA)

Son parvovirus, contienen DNA como material genético, y requieren la coinfección con un adenovirus para multiplicarse. Son vectores que combinan las ventajas de los retrovirales y los adenovirales. Su capacidad de integrar DNA exógeno es pequeña, sólo de 5 Kb.

Las principales ventajas son que los virus adenoasociados integran su DNA en la célula durante la replicación, por lo que la transducción (la cual es altamente eficaz) es estable en la célula diana. Además pueden infectar tanto a células en división como a las que no lo están (de gran importancia para la terapia génica "in vivo"). Los vectores AAV no están implicados en ningún tipo de enfermedad humana. Además el riesgo de una respuesta inmune está minimizado ya que no produce proteínas víricas.

Sin embargo existen también una serie de inconvenientes como que este tipo de vectores todavía no ha sido tan bien estudiado como los retrovirus y los adenovirus.

 - Herpesvirus

Son virus DNA cuyas células diana son las neuronas. Su complejidad y lo poco que todavía conocemos de esta familia de virus dificulta su utilización.

La gran ventaja es el gran tamaño de su DNA , que les permite aceptar varios genes terapéuticos, incluso podrían ir con sus propias regiones reguladoras.

Uno de los inconvenientes es que habría que eliminar las secuencias que codifican para las proteínas líticas del virus que causan la muerte de las células a las que infectan.

Como resumen de los vectores, podemos hacer una recopilación de las características que deberían presentar para obtener el vector ideal para su uso en terapia génica:
 - permitir la incorporación y expresión regulada durante el tiempo conveniente, de uno o más genes necesarios para la aplicación clínica requerida
 - ser específico en su transferencia génica
 - ser irreconocible para el sistema inmune y no inducir respuesta inflamatoria
 - ser estable y fácil de obtener

3. Enfermedades candidatas a la terapia génica

Contrariamente a lo que en principio se pensaba, las enfermedades hacia las que se ha dirigido la terapia génica no siempre corresponden a enfermedades genéticas. Entre las pruebas realizadas se han propuesto distintos tipos de patologías a tratar con esta metodología:

 * enfermedades monogénicas
 * cáncer
 * enfermedades infecciosas
 * otras enfermedades

Trataremos sobre los tres primeros apartados, comentando algunos ejemplos de enfermedades que ya se encuentran en ensayos clínicos con humanos:

3.1- Enfermedades monogénicas

INMUNODEFICIENCIA COMBINADA SEVERA

El gen defectuoso codifica una parte de un receptor celular que envía las señales a los progenitores de las células T y NK, componentes cruciales del sistema inmunitario. Sin el mando de este gen, las células no se desarrollan, no crecen y tampoco proliferan. Los pacientes están indefensos frente a la más leve infección. Los afectados están obligados a vivir en el interior de una burbuja estéril, bajo un estricto control hasta que se sometan a un trasplante de médula ósea.

En la actualidad existen 8 grupos de investigadores trabajando en esta enfermedad en fase I ó II. En todos los casos usan como gen terapeútico la adenosin desaminasa, y como vector un retrovirus, variando las células diana a las que va dirigido el vector así como la vía de administración de éste.

FIBROSIS QUISTICA

La fibrosis quística es una enfermedad heriditaria, autosómica recesiva frecuente en la raza caucásica (el gen defectuoso codifica para el canal de cloro conocido como CFTR). Se trata de una enfermedad generalizada de las glándulas exocrinas, caracterizada por un transporte anormal de electrolitos, que conduce a una enfermedad crónica obstructiva de los pulmones, insuficiencia pancreática exocrina y aumento de la cantidad de electrolitos en el sudor.

La enfermedad suele manifestarse por problemas respiratorios asociados con manifestaciones digestivas, diarrea crónica y retraso del crecimiento. Esta es la forma de presentación más frecuente. Sin embargo, a lo largo de la vida pueden aparecer signos y síntomas que configuran la historia natural de la enfermedad.

Actualmente existen 27 líneas de investigación en fase I ó II que en la mayoría de los casos (25 de ellos) utilizan como transgén CFTR, como células diana, las células del epitelio del tracto respiratorio (nasal y bronquial), siendo la via de administración en forma de aerosol. La única diferencia entre unos casos y otros son los vectores utilizados: liposomas y adenovirus.

HEMOFILIA

Existen dos tipos de hemofilia: la hemofilia "A" donde falla el factor VIII c: coagulante y la hemofilia "B", donde falla el factor IX c: coagulante.

Un hemofílico que padezca hemofilia A o hemofilia B, no sangra con mayor rapidez que las demás personas, sino que sangra más tiempo del habitual, y como su proceso de coagulación no es el normal, precisa administrarse el factor carente o deficitario de la coagulación con el fin de alcanzar unos niveles óptimos que le permitan una buena coagulación y pare el sangrado.

La hemofilia se manifiesta en forma de hemorragias, que pueden ser espontáneas o producidas por algún golpe o trauma. Las hemorragias internas que pueden empezar de forma espontánea sin causa aparente, si tardan en controlarse pueden dañar las articulaciones y los músculos. Este tipo de hemorragia puede ser incluso más grave que las hemorragias que afloran al exterior, aunque éstas sean más llamativas.

Hoy en día existen 6 líneas de investigación en fase I ó II, de las cuales 3 estudian la hemofilia A, usando como transgén el factor VIII, y las otras 3 la hemofilia B, usando como transgen el factor IX. Las 6 líneas son muy diversas:

 - vectores utilizados: retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, DNA desnudo.
 - via de administración usadas: subcutánea, intramuscular, intrahepática, intraperitoneal, intravenosa.

Existen más enfermedades que se están tratando las cuales pueden ser consultadas en la página web: http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/.

CÁNCER

El cáncer es una enfermedad que se caracteriza por el crecimiento excesivo y descontrolado de células que invaden y dañan tejidos y órganos. Los distintos cánceres presentan características y comportamientos diferentes, lo cual dificulta mayormente cualquier tipo de terapia. Por todo ello las investigaciones preclínicas y clínicas en la terapia génica del cáncer están orientadas hacia cuatro categorías distintas de estrategias:

 - La destrucción de las células tumorales mediante la expresión en ellas de productos tóxicos, o en su defecto, capaces de activar drogas que sí lo son.

 -  La estimulación de la respuesta inmune contra el tumor, potenciando los mecanismos del sistema inmune o modificando las células cancerosas para hacerlas más susceptibles a su destrucción.

  ia (alta virulencia o alto número de afectados) se ha profundizado más en ellos.

 - MELANOMA

El melanoma es una enfermedad de la piel consistente en una transformación cancerosa (maligna) de los melanocitos , que son las células que dan color a la piel. El melanoma generalmente ocurre en adultos, pero puede ocasionalmente encontrarse en niños y adolescentes. 

El melanoma es mucho más grave que otros tipos de cánceres de piel, como por ejemplo los llamados epiteliomas , que se originan en las células basales o escamosas (otros tipos de células de la epidermis). Como la mayoría de los cánceres, el melanoma se trata mejor cuando se detecta pronto. El melanoma puede diseminarse (por metástasis) rápidamente a otras partes del cuerpo a través de la sangre o del llamado sistema linfático (Los ganglios linfáticos son estructuras pequeñas en forma de alubia, que se encuentran en todo el cuerpo y cuya función es producir y almacenar células que combaten las infecciones).

Hasta momento existen 79 grupos investigadores trabajando en fases clínicas I ó II utilizándose genes que corresponden a moléculas participativas en el sistema inmune (antígenos, complejo de histocompatibilidad, citoquinas,...). En la mayoría de los casos las células diana son las células tumorales, siendo variada la vía de administración y los vectores usados.

 - GLIOBLASTOMA

Los tumores primarios del Sistema Nervioso Central (SNC) constituyen alrededor del 2% del total de las neoplasias en el adulto y el 20% en niños. Los gliomas son el tipo más frecuente, con una incidencia del 50% en la mayoría de los casos.

Actualmente existen 19 grupos investigando sobre terapia génica en glioblastomas. Se ha alcanzado la fase III por parte de algún grupo, siendo generalmente usados los retrovirus introducida por via intratumoral, tratándose de una terapia "in vivo". El gen usado más frecuentemente es la tirosina quinasa (TK).

ENFERMEDADES INFECCIOSAS

 - SIDA (Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirido)

Las siglas SIDA significan síndrome de inmunodeficiencia adquirida. Es una enfermedad infecciosa producida por el virus de la inmunodeficiencia humana (conocido con las siglas VIH) que afecta al sistema inmunitario disminuyendo las defensas del organismo.

De los 36 casos de estudios de terapia génica para enfermedades infecciosas en fase clínica, 35 de ellos son sobre el SIDA, todos ellos se encuentran en fase I ó II. El vector más usado es el retrovirus que se suele aplicar vía intravenosa. Las células diana son células sanguíneas siendo frecuente introducir genes de la cápside o la envoltura del virus HIV para que el organismo las reconozca y reaccione así el sistema inmunitario.

Existen más enfermedades que se están tratando las cuales pueden ser consultadas en la página web: http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/ 

En el caso de España los casos clínicos que existen en dicha base de datos son:

 

ID País Investigador Indicación Gen (es)
139 España J.M. Izquierdo Glioblastoma HSV-TK
425 España Jesús Prieto Carcinoma Hepatocelular y pancreático HSV-TK
570 España Bruno Sangro Carcinoma colorrectal, pancreático y hepatocelular IL-142

 

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