Boreas BOREAS  NATURAL

SEGURIDAD ALIMENTARIA: UTILIZACIÓN DE LA BIOTECNOLOGÍA GENÉTICA PARA LA DETECCIÓN DE FRAUDES ALIMENTARIOS

Calvo-Lacosta, J.H., Zaragoza, P., Rodellar, C Zarazaga, I. y Osta, R*.
Laboratorio de Genética Bioquímica y Grupos Sanguíneos. 
Facultad de Veterinaria. 
Universidad de Zaragoza. 
E-mail: osta@posta.unizar.es

Zaragoza, 1 de junio de 2001

  1. Resumen
  2. ¿Por qué realizar este tipo de análisis?
  3. ¿Qué tipo de técnicas se utilizaban en los ánalisis?
  4. ¿Por qué se piensa en la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)?
  5. Pero,¿qué tipo de análisis realizar?
  6. ¿Y los pates?, ¿y los quesos?
  7. ¿Puedo realizar el análisis un determinado alimento?
  8. Bibliografía

1. Resumen

En el Laboratorio de Genética Bioquímica y Grupos Sanguíneos de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza, se han desarrollado diferentes técnicas para la detección de fraudes en productos alimenticios. Así, detectamos de forma clara la existencia de algún producto de origen porcino (grasa o carne hasta una sensibilidad del 0.005%) en una serie de productos alimenticios ademas de cuantificar la cantidad existente. Tambien mediante la biotecnología genética podemos diferenciar las distintas especies que componen el queso, es decir diferenciar entre leche de vaca, cabra y oveja. Otro producto son los pates, como más tarde veremos tambien podemos distinguir la especies utilizadas para su realización: pato, pavo y pollo.

2. ¿Por qué realizar este tipo de análisis?

La espectacular expansión de la producción y el consumo que caracteriza actualmente a las sociedades económicamente desarrolladas ha generado una nueva necesidad: la defensa del consumidor contra los abusos y fraudes derivados del desequilibrio de fuerzas que hay entre consumidores y productores. Uno de estos fraudes podría consistir en realizar un producto elaborado y no mencionar en la etiqueta que parte del mismo estaba confeccionando determinados productos bases (carne de ave o cerdo). Este fraude es especialmente importante en el caso de la especie porcina, ya que existen determinados sectores de la población que por razones religiosas (religión judia y árabe entre otras) necesitan tener la seguridad de que los alimentos que ellos consumen no poseen en su composición carne de cerdo.

3. ¿Qué tipo de técnicas se utilizaban en los ánalisis?

Los primeros análisis llevados a cabo para conocer el origen de los diferentes tipos de carne no estaban basados en biología molecular. Así, los utilizados eran estudios de composición química (Crosland y cols,1995), estudios de las distintas proteínas que componen el alimento mediante electroforesis en gel (Savage y cols,1995), mediante microscopía (Pickering y cols,1995a) e incluso por inmunología (Pickering y cols,1995b). Sin embargo, cada uno de estos métodos presenta sus limitaciones. Los estudios de composición química presentan una gran variabilidad y los mismos autores no recomiendan este tipo de estudios para observar los distintos tipos de carne de las distintas especies animales que existen en los alimentos. En el caso de la utilización de electroforesis en acrilamida, a pesar de que los resultados obtenidos son mejores que los anteriores no se obtienen tampoco la diferenciación y se plantea el problema del estudio de las muestras una vez realizados los tratamientos que pueden desnaturalizar las proteínas.

4. ¿Por qué se piensa en la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)?

Ante estos antecedentes, el estudio de secuencias de ADN específicas para conseguir detectar la existencia o no de diferentes especies animales en los alimentos resultaba una metodología muy interesante. Hasta el momento se habían realizado algunos ensayos. Los primeros ensayos utilizaron técnicas de Dot-blot (Wintero y cols., 1990, Ebbehoj, K.F. y Thomsen, P.D.,1991),. Sin embargo, a pesar de que la sensibilidad era superior a la mostrada por métodos tradicionales, resultaba larga y costosa si se comparaba con la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa. No es pues de extrañar que fuera el método de elección con el fín de detectar fragmentos especie especifícos. 

La variación entre las distintas técnicas de PCR depende del fragmento que queremos amplificar. Se han utilizado regiones del genoma mitocondrial (Murray y cols, 1995; Meyer y cols.,1995) que tras la amplificación hay que cortar con endonucleasas. Otra opción eran regiones repetidas del cromosoma Y porcino, pero era posible detectar solo los animales machos.(Meer y Eddenger,1996 ). 

Otro de los retos consistía no solamente en detectar la carne de cerdo sino tambien cuantificar que cantidad del mismo existía en el alimento, ya que hasta el momento los diversos autores solo eran capaces de "semincuantificar" mediante la técnica de dot-blot (Meyer y cols., 1995).

Ante estos antecedentes, en el laboratorio de Genética Bioquímica y Grupos Sanguíneos de la Facultad de Veterinaria nos propusimos desarrollar un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa para detectar y cuantificar el porcentaje de DNA porcino en alimentos crudos o cocinados.

5. Pero,¿qué tipo de análisis realizar?

Lo primero que resultaba interesante era localizar la región genómica que ibamos a utilizar para la realización de la reacción en cadena de la polimerasa. Tras los antecedentes anteriormente expuestos resultaba interesante la utilización de una región que se encontrarse numerosas veces repetida en el genoma, pero no solamente en el cromosoma Y. Para ello se aisló en nuestro laboratorio un sine porcino ( entrada en la base de datos de secuencia AF235051) que fue utilizado para los análisis, cuya característica principal es su amplia distribución en el genoma porcino.

Para ver la efectividad de nuesro método nos dispusimos a probar nuestra amplificación en distintas tipos de carnes. Así, realizamos la extracción del DNA de carne cruda de cerdo doméstico, vaca, pollo, pavo y jabalí. Carne de vaca y cerdo tratada a 80ºC y 120ºC durante 30 minutos ya que (para ver la influencia de la temperatura). Otro tipo de alimentos fueron tambien testados Choped, Grasa, sebo o Manteca de cerdo, salchichas hechas de carnes de distintas especies, mortadela, amón serrano, cabeza de jabalí y jamón curado de Pato (para ver la influencia de la utilización de especies). Se realizó también el estudio en pates: Paté de cerdo, de pato de alta y baja calidad, de Salmón y de Oca. Por último y para observar la pureza de las hamburgesas, se realizó el análisis en hamburguesas de ternera y pollo de tres calidades distintas (alta, media y baja), cocinadas o no. (Las distintas calidades las valoramos según el precio del alimento, partimos de la base de que a mayor precio, mayor calidad y viceversa)

SENSIBILIDAD DEL MÉTODO

La cantidad mínima de ADN detectado fue de 1,25 pg que corresponde a una cantidad inferior al ADN contenido en una única célula. Este hecho confirma la suposición de que el fragmento utilizado es un retrovirus que se encuentra repetido muchas veces en distintos genes del genoma porcino, ya que no es necesaria la existencia del genoma completo para detectarlo.

Un resultado muy interesante fue la detección de un porcentaje de carne de cerdo en vaca del 0,005 %, en todas la muestras, ya fuesen carne fresca, tratada a 80°C durante 30 minutos, o a 120°C durante 30 minutos (tratada en autoclave). 

En el caso de las hamburguesas,. nuestros resultados mostraron que las hamburguesas de baja calidad aparecieron componentes porcinos mientras que las hamburguesas de alta calidad no los mostraron. Es de resaltar también la amplificación positiva sobre la grasa, el sebo y la manteca ya que esto permite detectar en las grasas su posible origen porcino. 

Como era de esperar, otros productos analizados fabricados a partir de carne porcina resultaron todos positivos (Choped, salchichas hechas de carnes de distintas especies, mortadela, jamón serrano y cabeza de jabalí). El jamón curado de pato resultó negativo a la amplificación del fragmento específico.

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Figura l.- Amplificación del fragmento 161 pares de bases específico de cerdo. Calle 1: vaca, calle2: ovino, calle 3: caprino, calle 4: pavo, calle 5: pato, calle 6: pollo, calle 7: caballo, calle 8: cerdo, calle 9: control negativo y calle 10: marcador de talla (BRL 1Kb, Gibco).
CUANTIFICACIÓN.

Como puede verse en la figura 2, se podía observar que el distinto porcentaje de DNA porcino en la muestra se correspondía con una mayor o menos intensidad de banda en el gel de agarosa. Tras varias pruebas realizadas y estudio densitométrico de las amplificaciones se puso a punto una técnica que nos permite cuantificar la cantidad de porcino existente en un alimento. Para ello se ha desarrollado una recta de regresión que permite conocer la cantidad con un error inferior al 5-6 %.

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Figura 2. Diluciones de ADN porcino en ADN vacuno (20 ciclos de amplificación del fragmento específico de cerdo). Calle1: marcador de talla (BRL 1Kb, Gibco), calle2: 100% cerdo (25 ng), calle 3: 75% cerdo (18.5 ng), calle 4: 50% cerdo (12.5 ng), calle5: 25% cerdo (6.25 ng), calle6: 10% cerdo (2.5 ng), calle7: 2% cerdo (500 pg) y calle 8: 1% cerdo (250 pg).

6. ¿Y los patés?, ¿y los quesos?

 Como ya hemos indicado antes la técnica anterior nos permitía conocer la existencia de productos porcinos en los patés, sin embargo, no podíamos conocer exactamente la composición de los mismos. Otro de los alimentos que nos interesan son los quesos.

Para ello se ha desarrollado un técnica, esta vez basada en amplificaciones al azar que nos permiten observar distintos patrones de bandas para las especies que componen estos alimentos.

Mediante esta metodología podemos diferenciar en el caso del paté el pollo, pavo, pato y oca. Y en el caso de los quesos, podremos saber si en el queso que nos venden hay leche de vaca, oveja o cabra.

7. ¿Puedo realizar el análisis de un determinado alimento?

 El laboratorio de Genética Bioquímica y Grupos Sanguíneos, dirigido por la Dra. Pilar Zaragoza lleva desde hace mucho tiempo realizando distintos servicios que pueden observarse en la página web, (http://wzar.unizar.es/invest/linv/lab.hym). Estos servicios se ofertan por medio de la Oficina de transferencia de investigación y estan abiertos a cualquier empresa, entidad pública o persona que los solicite. El precio de los mismos depende en gran medida del número de muestras a analizar y de la dificultad del análisis. Si estais interesandos enviar un e-mail a la responsable:

pilar.zaragoza@posta.unizar.es

8. Bibliografía

Crosland, A.R.; Patterson, R.L.S.; Higman, R.C.; Stewart, C.A.; Hargin, K.D. 1995. Investigation of methods to detect mechanically recovered meat in meat products: l: Chemical Composition. Meat Sci. 40: 289-302.

Ebbehoj, K.F.; Thomsen, P.D. 1991. Differentiation of Closely Related Species by DNA Hybridation. Meat Sci. 30: 359-366.

Meer, M.V. y Eddinger, T.J.1996. Polymerase chain reaction for detection of male tissue in pork products. Meat Sci. 44: 285-295.

Meyer, R.; Hofelein, C.; Luthy, J.; Candrian, U. 1995. Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis: A Simple method for Species Identification in Food. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 78(6): 1542-1551.

Murray, B.W.; McClymont, R.A.; Strobeck, C. 1995. Forensic identification of ungulate species using restriction digests of PCR-amplified mitochondrial DNA. J. Forensic Sci. 40(6): 943-951.
Savage, A.W.J.; Richardson, R.I.; Jolley, P.D.; Hargin, K.D.; Stewart, C.A. 1995. Investigation of methods to detect mechanically recovered meat in meat products: II: Gel Electrophoresis. Meat Sci. 40: 303-318.

Pickering, K.; Evans, C.L.; Hargin, K.D.; Stewart, C.A. 1995a. Investigation of methods to detect mechanically recovered meat in meat products: III: Microscopy. Meat Sci. 40: 319-326.

Pickering, K.; Griffin, M.; Smethurst, P.; Hargin, K.D.; Stewart, C.A. 1995b. Investigation of methods to detect mechanically recovered meat in meat products: IV: Immunology. Meat Sci. 40: 327-336.

Wintero, A.K.; Thomsen, P.D.; Davies, W. 1991. A comparison of DNA-Hybridization, Immunodiffusion, Countercurrent Immunoelectrophoresis and Isoelectric Focusing for Detecting the Admixture of Pork to Beef. Meat Sci. 27: 75-85.


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